툴젠 유전자가위 mRNA 혈우병 연구논문 번역본 - 사이언스 어드밴시스 기재 / 2022년 1월 24일
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유전학
지질나노입자를 이용한 CRISPR-Cas9의 생체내 전달은 지속 가능한 혈우병 A 및 B 치료를 위한 항트롬빈 유전자 편집을 가능하게 한다.
정필한1†, 김민정2†, 최범석3†, 이정현1, 이건성1, 미카엘라 정2, 이예지2, 김은아2, 혜경오3, 난영고3, 이혜림3, 이규준3, 김은기3, 이재영3, 김석중3, 준창2, 이혁진2*,송동우3*, 수청염1,4*
혈우병은 치료할 수 없는 유전적인 질병이다. 유전자 치료제 이중특이항체 치료와 같은 혁신적인 치료법이 도입되었지만, 억제제 환자에 대한 장기적인 치료 효과와 치료 선택권을 달성하는 것과 관련하여 여전히 충족되지 않은 상당한 요구가 존재한다. 트롬빈 생성의 내인성 음성 조절기인 안티트롬빈(AT)은 혈우병 환자 A와 B의 지속 가능한 치료를 위한 잠재적 게놈 편집 대상이다. 본 연구에서는 마우스 간에서 AT를 대상으로 하는 단일 가이드 RNA와 함께 Cas9 mRNA를 전달하기 위해 지질 나노 입자(LNP)를 개발하고 최적화했다. LNP 매개 CRISPR-Cas9 전달은 AT의 억제를 초래하여 트롬빈 생성을 개선시켰다. 혈우병인 A와 B 생쥐 모두에서 출혈과 관련된 형태들이 발견되었다. 표적 외 활성, 간 유도 독성, 실체적 항Cas9 면역 반응이 검출되지 않아 LNP 매개 CRISPR-Cas9 전달이 혈우병 치료를 위한 안전하고 효율적인 접근법이었음을 알 수 있었다.
소개
혈우병은 본질적, 외생적, 공통적인 응고 경로(1)와 관련된 유전자 기능의 상실로 인한 자발적 출혈이 있는 대표적인 유전질환이다. 근본적인 치료법은 아직 개발되지 않았으며, 혈우병인 A와 B가 유전자 치료의 가장 중요한 대상 중 하나이다. 혈우병에 가장 많이 사용되는 치료법은 혈우병의 종류에 따라 결손응고인자가 보충되는 예방이다. 아데노 관련 바이러스(AAV) 유전자 치료법이 임상시험을 거쳤으며 부족한 응고인자를 회복하는 데 효과가 있는 것으로 나타났다. 그러나 이 접근법은 혈우병 A와 혈우병 B의 경우 각각 약 30과 10%를 차지하는 인자 VIII 또는 FIX에 대한 억제제를 가진 환자에게는 적합하지 않다. 억제제는 항체를 중화시키고 있으며, 중증 혈우병 환자의 95%가 FVIII 대체 치료 후 첫 75일 이내에 억제제를 개발한다(4).최근에는 억제제 환자에게 다양한 치료전략이 제시되고 있다. 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 이중특이 항체인 에미시주맙은 억제제가 있는 환자 치료에 임상적으로 사용되어 왔으며, 다운스트림 응고 경로(5)에 대해 FIX와 FX를 연결하는 FVIII 기능을 모방하는 우회 전략을 포함한다. 그러나 이 접근법은 환자가 평생 동안 반복 주사를 맞아야 한다. 피투시란은 안티트롬빈(AT)(6)을 표적으로 하는 RNA 간섭 치료제로, 혈우병 환자 A와 B를 모두 포괄하는 치료 전략에 활용돼 왔다. AT는 세르핀 계열 C 멤버 1(SERPINC1) 유전자에 의해 암호화되는 트롬빈 생성의 내인성 음성 조절제이다. ATusing fitusiran의 억제는 응고 인자의 직접적인 발현 없이 응고 시스템의 균형을 회복시키는 강력한 우회 방법임이 입증되었다. 이 접근법은 질병이나 억제제의 발생에 책임이 있는 인자에 관계 없이 혈우병 환자 대부분에게 적용 가능하기 때문에 매력적이고 다용도적인 전략이다. 그러나 이 전략의 한계는 피투시란(6, 7)의 단기 치료 효과이다.현재까지 혈우병 치료에 승인된 모든 전략이 일시적인 치료 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다.그러나 반복적인 치료는 혈우병 환자의 삶의 질에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 최근에는 혈우병 환자의 기대수명이 늘어남에 따라 보다 긴 주기적 치료 기간(8, 9세)이 필요하다. 따라서 지속 가능하고 안전한 장기적 효과를 고려하는 것은 혈우병 치료에서 가장 중요한 고려사항 중 하나이다.이런 점에서 유전자 치료는 장기적인 치료 효과를 유지하는 데 적합하다. 특히, AAV의 치료 효과는 몇 년 동안 보고되었으며(10) 다양한 AAV 혈청형을 이용한 유전자 치료 연구가 진행되고 있다. 그러나 AAVshas의 사용은 면역유전성과 무작위 통합(11, 12)으로 인해 제한되었다.
바이러스 전달 시스템을 사용할 때 직면하는 주요 한계 중 일부인 장기 Cas9 발현 관련 면역 유발성. Cas9 단백질은 선천적 및 세포 면역 반응(18)을 유도할 수 있으며, 이러한 면역 유발은 편집된 세포의 용해로 인해 안전 문제와 연관되고 장기적인 치료 아웃을 방지하고, 이는 혈당 세포(19)와 같은 항원 제시 기능을 가진 세포에서 더 위협적이다. 이에 비해, 비바이러스 전달 접근법은 CRISPR-Cas9의 일시적인 발현으로 인해 표적을 벗어난 효과를 감소시켰다. CRISPR-Cas9의 표현은 비교적 간단하지만, 대상 게놈 사이트를 편집하기에 충분하다. 따라서 최근의 연구는 생체 내 게놈 편집 치료를 위한 보다 적합한 전달 도구(20)로서 폴리머 또는 지질 기반 매개체와 같은 비바이러스 전달 시스템에 두드러지게 초점을 맞추고 있다.본 연구에서는 CRISPR-Cas9 매개 ATediting이 혈우병 A와 B를 치료하기 위한 장기적이고 다용도적인 치료 옵션을 나타낼 수 있다는 가설을 세웠다. 우리는 Cas9 mRNA를 마우스 AT(mAT)를 대상으로 하는 포텐팅글 가이드 RNA(sgRNA)와 함께 주제 간으로 전달하기 위해 지질나노입자(LNP)를 개발하고 최적화했다. 다음으로 mAT 유전자 편집 매개 트롬빈 생성을 혈우병 A 및 B 마우스 모델에서 평가하여 개발된 시스템의 치료 효과를 확인했다. 여기서, 우리는 LNP를 이용한 CRISPR-Cas9의 생체 내 전달이 지속 가능한 혈우병 A와 B 치료를 위한 ATgene 편집을 가능하게 한다는 것을 입증한다.
결과
체외 검사에 의한 SERPINC1 유전자의 잠재적 sgRNA 선택
mAT 게놈 편집에 의한 혈우병 치료(그림 1A)의 경우 Serpinc1 exon 3을 대상으로 한 sgRNA 후보물질은 최소 표적외 위험(그림 S1A)을 기준으로 선택되었다. 최대 2-염기쌍(bp) 불일치를 포함하지 않은 11개의 sgRNA는 아리보핵단백질(RNP) 제형으로 마우스 C2C12 세포주로 전달되었다. 삽입 또는 삭제(인델) 빈도를 표적 딥 시퀀싱으로 분석했습니다. 3개의 sgRNA가 1차 선별(그림 S1B)에 의해 선택되었으며, TS4 sgRNA는 사후 비교 테스트에서 가장 강력한 것으로 나타났다(그림 1B). 비록 C2C12 세포 라인이 잘 전달되고 sgRNA 활성 스크리닝에 편리했지만, AT 규정상 표적 세포에 가깝지는 않았다.따라서 마우스 1차혈구에서 세 가지 sgRNA를 테스트했고, TS4 sgRNA는 지속적으로 가장 높은 인델(그림 S1C)로 이어졌다. 따라서 TS4 sgRNA는 시험관내 연구 후 추가 LNP 매개 생체 내 연구를 위해 선택되었다.
버퍼 수정에 의한 생체 내 간세포 전달에 대한 LNP 최적화
Cas9 mRNA와 sgRNA의 생체 내 전달을 위해 LNP는 246C10, 디올레오일포스파티딜타놀아민(DOPE), 콜레스테롤, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-세라마이드를 사용하여 공식화되었다. 원하는 용량에서 표적 게놈 편집을 효율적으로 유도하기 위해 고도로 수정된 sgRNA가 본 연구에서 사용되었다. 포스포토싸이오레이트 결합은 sgRNA의 5' 말단 및 3' 말단에 도입되었다. 또한 앞서 설명한 바와 같이 sgRNA의 줄기 루프에 2'-O-메틸이 도입되었다. 정의된 입자 크기와 분포로 LNP를 공식화하기 위해 급속 미세 유체 혼합 시스템이 사용되었다(그림 2A). 수용기에서 Cas9 mRNA와 mAT-표적체sgRNA는 구연산 나트륨(pH 3) 또는 아세트산 나트륨 완충액(pH 5)으로 1:1 무게 비율로 용해되었다. 카스9m의 결합RNA와 sgRNA는 미세 유체 시스템을 사용하여 수행되었으며, RNA 분자의 캡슐화를 확인하기 위해 다양한 완충 조건을 시험하였다. 우리는 고도로 변형된 sgRNA가 LNP 내 RNA의 캡슐화 효율성 저하에 기여하는 것을 관찰했다(그림 S2). 또한 sgRNA의 화학적 변형 정도에 따라 sgRNA의 캡슐화 효율은 상당히 달랐다(그림 2B). 고도로 수정된 sgRNA는 낮은 캡슐화 효율성(~50%)을 입증한 반면, 최종 수정된 sgRNA는 거의 85%(P = 0.0002)의 캡슐화 효율성을 나타냈다.
이전의 연구들은 고도로 수정된 sgRNA를 사용하는 것이 최종 수정된 sgRNA(16, 21)보다 우수한 게놈 편집을 가져온다는 것을 입증했다. 따라서, 우리는 LNP에서 고도로 수정된 sgRNA의 캡슐화를 보장하기 위해 버퍼 조건을 최적화하려고 시도했다. 다양한 농도의 염화나트륨(NaCl)이 존재하는 조건에서 sgRNA의 캡슐화를 최적화하기 위해 구연산염 또는 아세테이트의 다른 완충 조건을 평가했다. 이온 버퍼 강도와 pH는 미세 유체 혼합 시 중요한 매개변수이다. 낮은 pH(10 mM, pH 3)에서의 시트르산 완충제는 RNA 캡슐된 LNP를 준비하여 RNA의 염기 가수분해를 감소시키는 데 종종 사용된다. 또한 시트르산 완충액에서 대부분의 이온화 가능한 지질 아민은 양전하를 띠고 있어(246C10 이온화 지질 pKa는 6.9) 전달 가능한 지질은 음전하를 띤 RNA와 전기정지로 상호작용할 수 있다. 그러나 높은 pH(50 mM, pH5)에서 아세테이트 완충제의 효과를 조사하고자 하였습니다. 따라서 시트레이트 완충제를 사용하여 생성된 고도로 변형된 sgRNA 캡슐화 LNPs가 낮은 캡슐화 효율성(68%)을 가지며 상대적으로 더 많은 헤테로디스퍼스(PDI > 0.9)를 보였다(그림 2C). 미세유체 혼합 시 시트레이트 완충액을 사용하여 LNP를 생성하였고, 미세유체 혼합 시 시트레이트 완충액을 선택하였습니다. 또한, 우리는 이온 강도와 캡슐화 효율을 높이기 위해 미세 유체 혼합 중 NaCl을 추가했다. 이전에 핀 외 연구진(16)은 미세 유체 혼합 중 NaCl을 통합하여 고도로 수정된 sgRNA의 높은 캡슐화 효율성을 제공했다. 연구를 바탕으로, 우리는 버퍼에 추가된 NaCl의 양을 최적화했습니다.주제액 혼합 중 완충 시스템에 추가된 NaCl의 양은 sgRNA를 공식화된 LNP로 캡슐화하는 데 큰 영향을 미쳤다(그림 2C). 그러나 고도로 수정된 sgRNA는 일정량의 이온 강도를 캡슐화해야 했다. Cas9 mRNA와 mAT sgRNA의 공집합(20 mM NaCl의 7 mM 구연산염), 좁은 PDI로 90% 이상의 캡슐화 효율성을 입증했다. 이러한 결과에 기초하여 추가 연구를 위한 초기 제형보다 더 나은 RNAencapsulation 효율성(>90%)을 가진 이 완충 조건을 선택했다. 다음으로, LNP의 장기 특이적 전달 가능성은 정맥 경로를 통해 LNP로 포장된 루시퍼레이스를 도입함으로써 확인되었다. 특히 마우스 간은 유전자 전이 발현도가 높았지만 다른 기관에서는 검출 가능한 루시퍼레이스 발현(그림 2D)이 나타나지 않았다.
Spcas9 및 sgRNA로 포장된 LNP에 의한 mAT의 지속적인 다운 조절
생체 내 mAT 표적은 간세포 전달을 위해 LNPCRISPR-mAT를 최적화한 후 시도되었다. 사람의 경우 혈우병 A와 B가 대표적인 응고 장애 유형이며, mAT 발현의 하향 조절은 혈우병 A와 B 모두에서 임상 증상을 개선시켰다(7, (7, 22, 23) 혈우병의 가장 흔한 유형인 혈우병 A는 FVIII 유전자(F8I22I)의 22번째 인트론 역전(24)으로 인해 발생하는 심각한 응고 장애이다. 반면에 혈우병 B는 FIX 유전자(F9Mut)의 기능 상실에 의해 발생한다. 따라서 F8을 가진 쥐는이 생쥐는 CRISPR-Cas9 매개 유전자 편집을 사용하여 생성되었고 혈우병 표현형에 대해 검증되었다. 시험 용량으로 LNP-CRISPR-mAT를 2주 간격으로 정맥 경로를 통해 마우스당 1.2mg/kg(mpk)을 투여하였다(그림 3A). 생체발광 신호는 낮은 루시퍼레이스 mRNA 용량에서 쉽게 검출되었다. 그러나 표적 세포에서 치료적으로 관련된 Cas9 단백질을 생산하기 위해서는 더 높은 선량이 필요했다. LNP-CRISPR-mAT는 간 조직에서만 검출 가능한 인델을 개발했다(그림 3B 및 무화과). S3)과 F8I22I와 F9Mut의 지방발행에서 각각 22%와 38%의 지워지지 않는 주파수의 혐오가 관찰되었다(그림 3C). 또한 LNP-CRISPRMAT는 프레임시프트로 지배적인 1~2 bp 삭제를 개발하여 mAT의 기능 상실을 개선하였다(그림 3D).이중가닥 DNA 파손이 지방세포에서 관찰되었기 때문에 혈중 mAT 농도를 평가하여 mAT 기능을 평가하였다. LNP-CRISPRM 투여 시2주 간격으로 세 번 혈액을 분석했습니다.이 기간 동안 야생형(WT) 마우스를 사용하여 반복적으로 AT 농도를 조절한다. mAT 농도는 LNP-CRISPR-mAT 주입의 반복 라운드에 따라 감소하였으나 첫 번째 LNP-CRISPR-mAT 주입 후 10주에 안정되었다(그림 3E). 따라서 고도로 변형된 sgRNA와 SpCas9 mRNA를 LNPs에서 포장하여 반복적으로 투여했을 때, Serpinc1 유전자 기능은 평균 mAT 값 대비 70% 이상 하향 조절되었고, Serpinc1은 10개월 동안 안정적으로 하향 조절되었다. 그러나 대조군 WT 마우스는 반복적인 샘플링을 통해 유전자 발현 변화를 분석하는 데 유용하지만, mAT 발현은 대조군 WT와 혈우병 마우스 모델 사이에 차이가 있을 수 있다.따라서 LNP-CRISPR-mAT를 F8I22I와 F9Mut를 가진 생쥐에 투여하고 혈액 mAT 농도를 평가하였다.혈중 mAT 농도가 F8I22I에서 약 40%, F9Mut 마우스에서 70% 감소하는 것을 관찰했다(그림 3F).
LNP-CRISPRM을 사용하여 구조된 트롬빈 생성 활성혈우병 쥐의 AT
응고 장애를 평가하는 데 사용할 수 있는 다양한 진단 방법 중 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT) 테스트와 보정된 자동 트롬빈(CAT) 생성법이 널리 사용된다(27). 그러나, aPTT는 응고 잠재성의 초기 단계를 평가하는 데 적합하기 때문에 재조정의 치료 효과 분석에는 유용하지 않다(28). 반면에 CAT는 100분 이상 트롬빈 생성을 측정할 수 있으며 재조정 효과(6)를 평가하는 데 적용할 수 있다. 특히 LNP-CRISPR-mAT 처리는 F8I22I와 F9Mut 마우스 모두에서 트롬빈 생성 잠재력을 회복시켰다. LNP-CRISPR-mAT는 F8I22I 및 F9Mut에서 지연 시간을 단축하고 트롬빈 피크(Trombin Peak)를 증가시켰다. 또한 LNP-CRISPR-mAT 처리 결과 트롬빈피크가 WT의 약 65%까지 향상되었다. 트롬보그램을 사용하여 식별된 트롬빈 피크 및 총 트롬빈 형성 능력을 기준으로 LNP-CRISPR-mAT 처리가 F8을 가진 마우스에서 트롬빈 생성 능력을 향상시켰다는 점에 주목했다.I22I 및 F9Mut(그림 4, A 및 B)
혈전 가능성이 증가하여 자발적 출혈 및 2차 혈우울증 감소
CAT 분석은 LNP-CRISPR-mAT 매개 재조정으로 인한 응고성 개선을 입증했다. 그러나 혈우병의 상당한 합병증인 자발적 출혈의 감소를 평가하는 것 또한 필수적이었다. 혈우병 환자에게서 발견되는 가장 흔한 자발적 출혈 부위는 뇌와 관절(29, 30)이다. 그러나 뇌와 혈우병의 관절에서 출혈 병변을 관찰하지는 않았다(그림 S4). 조직병리학적 분석 결과 혈우병 생쥐의 두 그룹에서 간질 간 부위에서 자발 출혈이 나타났다(그림 5A). 조직 부분에서 검출된 적혈구(RBC)의 총 수를 측정하여 출혈 빈도 또는 심각성을 확인하였다. RBC는 자동 형광(31)을 나타내기 때문에 470-nm와 530-nm 파장에서 동시 발현으로 생성된 거짓 노란색 신호는 RBC에 의해 생성된 자동 형광으로 정의되었다. 각 마우스에서 간의 10개 부위를 무작위로 선택했고, 노란색 형광의 치수 비율을 정량화했다. 예상대로 LNP-CRISPR-mAT를 사용한 치료는 간 조직에서 RBC의 빈도를 감소시켜 자발적 출혈에서 발생을 나타냈다. 특히 각 마우스에서 mAT 농도와 RBC 주파수 사이에 유의미한 상관관계가 있었다(P = 0.0065). (그림 5A)신장 병변은 혈우병 환자(32개)에게 흔하지 않지만, 이 연구에서 신장의 예상치 못한 조직학적 변화가 관찰됐다. F8I22I와 F9 Mut 혈우병 생쥐 모두 Bowman's capsule에서 특징적인 부종 증상을 보였다(그림 5B).그러나 대조군 WT 마우스에서는 이러한 증상이 감지되지 않았다.따라서 신장에도 LNP-CRISPR-mAT의 치료 효과를 평가했다. 이를 위해 각 생쥐의 키드니에서 3개의 섹션을 무작위로 선택하여 보우만 캡슐의 모양을 분석했습니다. LNP-CRISPR-mAT 치료법은 부종 증상을 감소시켰으며, F8I22I 및 F9Mut 마우스의 일반 사구체 캡슐의 전체 비율은 대조군 WT 마우스와 유사했다(그림 5B). 이러한 관찰은 LNP-CRISPR-mAT 치료를 통한 재조정이 단열되고 mAT 농도를 감소시켜 결과적으로 혈우병의 임상 증상을 개선한다는 것을 확인했다.
검출 가능한 CRISPR-LNP 매개 부작용 없음
생체 내 유전자 편집에서 가장 중요한 합병증은 바람직하지 않은 표적 외 효과의 발생이다. 따라서, 우리는 먼저 인실리코 방법을 사용하여 최대 트리뉴클레오타이드(표 S1)만큼 표적 sgRNA 시퀀스와 다른 7개의 가장 높은 잠재적 오프타겟 사이트를 선택했다. 또한 Digenome-seq(33)를 사용하여 게놈 전체에 걸친 탐지가 수행되었고, 절단 점수가 대상 사이트보다 상당히 낮은 세 개의 잠재적 사이트를 추가로 발견했다(그림 6A 및 표 S1). 다음으로 총 10개의 대상 외 후보가 LNP-CRISPR-mAT로 처리된 마우스에서 후속적으로 검증되었다. 대조군 WT, F8I22I, F9Mut(n = 3)의 간 게놈 DNA를 사용한 표적 심층 염기서열 분석에서는 두 혈우병 모델 모두에서 잠재적 오프사이트에서 의미 있는 인델이 나타나지 않았다(그림 6B).LNP-CRISPR의 또 다른 중요한 안전 문제는 면역 반응 또는 염증이다. 아스파르트산 아미노기 전이효소(AST)와 알라닌 전이효소(ALT) 분석에 혈장을 적용하였으며, 그룹 간 차이는 거의 없었다. 따라서 LNP-CRISPR-mAT 투여는 간 손상을 유발하지 않았다(그림 6C). 다음으로, LNP-CRISPR에 대한 염증 반응은 측정 종양 괴사 인자–γ (TNF-γ) 및 인터류킨-1' (IL-1) 농도로 평가되었다. LNP-CRISPR 주사 후 염증성 사이토카인 생산량이 눈에 띄게 증가하지 않았다(그림 6D). 또한 LNP 주입 마우스 세라프롬을 사용하여 전신 항체 반응 효소 연결 면역흡착 검사(ELISA)를 조사했다. LNP 빈 시술과 비교하여 항-Cas9 면역글로불린 G(IgG)는 반복된 LNP-CRISPR-mAT 주입으로 유발되지 않았다(그림 6E). 그러나 마우스를 AAV-Cas9로 정맥주사로 치료한 결과 6주 치료 후 계통적으로 상승된 항Cas9 IgG가 검출되었다(그림 6E). 이는 반복된 LNP-CRISPR 주입이 지속적인 AAV 매개 Cas9 발현보다 면역 유발성이 낮은 접근법임을 시사한다. 다음으로, 우리는 sgRNA/Cas9 mRNA에 포함된 LNP의 반복 투여가 Cas9 단백질을 발현하는 세포에 대한 세포 면역 반응을 유도하는지 여부를 평가했다. 세포 면역 반응은 특히 CD8+ 세포독성 T 림프구에 의해 매개되기 때문에, 생쥐 스플레노사이트에 대한 Cas9 단백질 도전 후 인터페론-γ(IFN-γ) 수준을 결정함으로써 생쥐 스플레노사이트(34)에서 항Cas9 T 세포의 존재를 확인했다.반복된 LNP 주입은 마우스에서 세포 면역 반응을 유도하지 않았다(그림 6F 및 그림 S5).
논의
혈우병은 주로 FVIII 또는 FIX 유전자(35)의 기능 상실 돌연변이에 의해 발생하는 X-연관 열성 유전 질환이다. 부족한 응고인자 단백질을 공급해 예방하는 방식이 클리닉에서 폭넓게 활용되고 있지만, 잦은 투여와 고비용, 억제제 발생의 필요성은 환자의 삶의 질(36)에 부정적인 영향을 미친다. 따라서, 현재 이 문제를 해결하기 위해 고급 치료 전략이 개발되고 있다. 본 연구에서는 SERPINC1 인코딩 AT의 게놈 편집이 혈우병 환자를 치료하기 위한 잠재적인 고급 치료 옵션으로 사용될 수 있는지 여부를 평가했다. 우리는 CRISPR-Cas9의 LNP 매개 전달이 혈우병 A와 B 마우스 모델에서 mAT와 개선된 트롬빈 생성 및 출혈 관련 표현형을 억제하는 결과를 초래한다는 것을 입증했다. 특히 LNP-CRISPR-mAT의 투여는 억제제가 있거나 없는 환자를 치료할 수 있는 유연한 기회를 제공할 수 있으며, 제한된 용량(7회)으로도 장기적인 치료 효과를 발휘한다. 또한, 우리는 비-바이러스 전달 SpCas9 및 sgRNA가 뚜렷한 표적 이탈 효과 없이 간 Serpinc1을 효과적으로 표적화했음을 입증했다.따라서 이러한 CRISPR-Cas9 호환 전달 도구는 임상 적용 가능성 또한 가질 수 있다. LNP-CRISPR-Cas9를 사용한 유사한 접근법은 최근 트란스티레틴(ATTR) 아밀로이드증(NCT04601051) 환자를 이용한 인체 실험을 거쳤다. 결과는 LNP-CRISPR-Cas9이 효과적으로 병원성을 억제한다는 것을 보여주었다.경미한 부작용(37)으로 약 90%의 TTR 발현으로 이 접근법의 번역 가능성을 입증했다.AT 및 조직 인자 경로 억제제(38, 39)와 같은 항응고 인자의 결핍을 함께 유전하는 혈우병 환자에서 출혈혈소형이 실질적으로 개선된다는 관찰 때문에 응고 경로의 균형을 재조정하는 치료적 적용이 강력하게 권장된다. AT는 인자 XIa, XIa, IXa, Xa, VIIA, 트롬빈(IIA)과 같은 다양한 응고 관련 유전자를 억제하는 반면 TFPI는 가역적으로 요소를 억제한다.VIA와 Xa(41). 따라서 AT 또는 TFPI의 기능 상실은 항응고 활성을 감소시킴으로써 손상된 균형을 회복할 수 있다. 콩키주맙과 마르스타시맙을 포함한 단일클론 항체를 이용한 TFPI 표적화 접근법이 임상적으로 테스트되었다.그러나 관련된 임상 요법은 각각 콩키주맙과 마르스타시맙에 대한 일일 주사 및 주 1회 주사이다(42회).따라서, TFPI의 게놈 편집은 더 오래 지속되는 전략으로 보이며, TFPI를 대상으로 하는 일부 강력한 sgRNA는 인간 게놈에서 관찰되었다(그림 S6). 특히, TFPI는 다양한 세포 유형(43)으로 발현되며, 여러 조직을 대상으로 하는 전달 방법의 개발은 TFPI 편집 접근법의 임상적 번역을 촉진할 수 있다. 대신, 본 연구에서 개발된 전달 도구는 AT 분비의 주요 원천인 간을 목표로 하는 데 매우 강력하기 때문에 SERPINC1 편집 전략의 번역이 더 빠른 접근 방식일 수 있음을 제안한다. 인간 SERPINC1을 대상으로 한 일부 sgRNA는 효과적인 인델과 프레임 외 부분을 발생시켜 일시적 매개 붕괴 메커니즘을 통해 녹아웃을 유도했다(그림 S6). 따라서 이러한 sgRNA 후보들은 다음 리드 최적화 단계에 고려될 수 있다.신기술 개발을 위한 엄청난 노력이 다양한 난치병을 앓고 있는 환자들을 치료하는데 기여했다(44, 45). 구체적으로, AAV 매개 유전자 대체 치료는 현재 단백질 대체나 항체 매개 치료보다는 장기적인 치료의 옵션으로 널리 받아들여지고 있다. 혈우병에서 AAV-FVIII의 임상시험은 투여 후 몇 년 이내에 FVIII의 수치가 감소하는 것을 보여주었고, AAV-FIX의 임상시험은 10년 이상 지속된 효과를 보여주었다(46, 47). 이러한 감소의 이유는 증명되지 않았지만, FVIII의 내인성 근원이 아닌 간세포에서의 FVII의 발현이나 분비가 관련이 있을 수 있다. FVIII의 인트론 22 또는 인트론 1과 같은 일반적인 돌연변이를 직접적으로 교정하는 게놈 편집 전략이 제안되었다(48).그러나, 정현상 내피 세포 표적화 전달 시스템과 높은 역전 효율성의 요건은 그러한 접근법의 적용을 제한할 수 있다. 따라서 장기 치료 접근법과 결합된 다른 우회 전략은 현재 접근법의 치료 효과의 짧은 지속 시간과 관련된 한계를 극복하는 데 도움이 될 수 있다. SERPINC1 편집 전략은 환자 모집단을 광범위하게 대상으로 할 수 있는 우수한 치료 옵션이라고 가정한다.본 연구에서는 CRISPR-Cas9을 전달하기 위해 LNPs를 적용했습니다. F8I22I 및 F9Mut 마우스에서 LNP 처리를 연속적으로 반복 투여하여 AT 발현을 각각 약 40%, 70% 억제하였다. 또한 억제 수준은 혈우병 모델 모두에서 표현형 회복에 의해 동반되었다.
재료 및 방법
SsgRNA 스크리닝
마우스 C2C12[American Type Culture Collection(ATCC),CRL-1722] 세포 또는 인간 저캣(ATCC, TIB-152) 세포를 4M 글루타민(4.5g/bo), 1M 나트륨, 피루브산 태아 펜 10%로 보충했다.초기 sgRNA 스크리닝의 경우, 인간 최적화된 SpCas9을 인코딩하는 플라스미드와 sgRNA 또는 RNP 복합체가 1µg의 sgRNA와 함께 11-µg의 네온 트랜스펙션(생명 기술, 칼스배드 CA, USA)의 10-µl 팁을 사용하여 15ms 동안 전기 충격을 받았다. 추가 비교 테스트를 위해 마우스 1차 간세포(4 × 105 세포)는 3개의 선택된 sgRNA(TS2, TS4, TS11)에 대해 1µg의 LNP로 처리되었다. 3일 수혈 후 세포를 채취하고 DNeasy Blood and Tissue Kit(독일 Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 게놈DNA를 추출하였다.
LNP 준비
LNP는 명확하게 설명된 방법(26)에 따라 NanoAssemblylr Benchtop Instrument(캐나다 밴쿠버의 Precision Nanosystems Inc.)를 사용하여 준비되었습니다. 지질 성분(26.5:20:52:1.5 몰라티오에서 이온지질, DOPE, 콜레스테롤, PEG 지질)은 에탄올에 용해되었으며, RNA(Cas9 mRNA/sgRNA at 1:1 중량비)는 10 mM 시트레이트 완충액(PH 3)에 용해되었다. 최종 이온화 가능한 지질:RNA 무게비는 10:1이었고, 최종 용적비는 1:3이었다. LNP는 제조된 용액을 12 ml/min 유량으로 미세 유체 혼합하여 제조되었다. 생성된 LNP는 완충액을 교환하기 위해 3500-분자량 차단 투석 카세트(LifeTechnologies)를 사용하여 1배 인산염 완충 식염수(PBS)에 대해 16시간 동안 투석하였다. 준비된 LNP의 특성을 나타내기 위해 동적 빛 산란을 사용하여 LNP의 크기, PDI 및 제타 잠재력을 확인했습니다. RNA의 캡슐화 효율은 Quant-iTTM 리보그린 분석(LifeTechnologies)에 의해 측정되었다.
LNP의 생체내 생물분포 분석
무게가 18~20g인 C57BL/6 마우스는 오리엔트 바이오(경기 성남)에서 구매했다. 반딧불이의 루시퍼레이스인코딩 mRNA (0.1 mpk 복용량)를 가진 LNP를 정맥 내 주입했다. 3시간 후 쥐에게 복강 내 d-루시페린을 주입하고 15분간 배양했다. IVIS(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 전신 및 생체 외 기관의 생체 발광 영상을 수행했다. 모든 동물 연구 절차는 이화여대 기관동물보호 및 사용위원회(기관동물보호 및 사용위원회 19-022)의 승인을 받았다.
LNP-CRISPRC57BL/6 (B6) 생쥐에 대한 동물실험은 코아텍(한국 평택시)에서 구매했다. B6.FVIII 인트론 22 반전(F8I22I) 및 B6.FIXknockout(F9Mut)은 CRISPR-Cas9 기반 제네디팅(그림 S7)(56)에 의해 생성되었다. 7~9주 된 수컷 쥐는 추가 실험을 받았다. B6와 각 혈우병 생쥐를 무작위로 나누고, 그 중 절반은 LNP 포장 SpCas9 mRNA와 고도로 변형된 sgRNA(LNP-CRISPR-mAT)를 2주 간격으로 3회 투여했다. 주입 용액은 LNP-CRISPR-mAT 1.2mpk를 혼합하여 준비했으며 정맥 경로를 통해 600µland까지 따뜻한 식염수를 주입했다. 600µl의 주사 용액은 간에서 유체역학적 유전자 전달을 유도할 수 없었다(그림 S8). B6 쥐는 18주 동안 꼬리 정맥을 통한 반복 혈액 샘플링을 받았다. 혈우병 쥐는 첫 번째 LNP-CRISPR-mAT 주사 이후 8주 만에 안락사되었다. 하대정맥에서 총 450µf 신선혈액을 채취해 구연산나트륨 3.2% 50µl와 혼합한 뒤 원심분리 후 상등액을 채취해 혈장을 준비했다. 혈액 샘플 채취 후, 각 기관은 관류 없이 채취되었고, 조직의 일부는 포르말린에 의해 고정되었고, 잔여물은 게놈 DNA 추출에 사용되었다. 본 연구는 서울대학교 동물보호 및 사용위원회(SNU-200715-2)의 승인을 받았으며 승인된 지침에 따라 수행되었다.
중합효소 연쇄 반응, T7E1 분석 및 표적 딥 시퀀싱
유전자 DNA는 G-DEX IIcgenomic DNA 추출 키트(Intron Biotology, 경기도, 한국)에 의해 장기 조직에서 추출되었다. 프라이머는 LNP-CRISPRM을 확장하기 위해 설계되었다.AT 표적 게놈 영역. 다음으로 T7E1 분석에서 중합효소 연쇄 반응(PCR) 엠프리콘은 이종 이중 하이브리드화와 T7E1 핵산 중간 분해 효소(New EnglandBiolabs, Ipswich, MA, USA) 배양에 30분 동안 노출되었다. 겔 전기 영동에서 절단 밴드의 존재는 유실 형성으로 지정되었습니다. 심층 염기서열 분석에서 흥미로운 게놈 영역은 이식된 세포 또는 LNP 주입 조직에서 추출한 게놈 DNA로부터 PCR에 의해 증폭되었다. 생산된 엠프리콘은 Illumina TrueSeq 어댑터와 함께 바코드로 지속되었다. 제품들은 PCR 정화 키트(Geneall, Seoul, Korea)로 정제된 후 등극비로 고르게 되었다. 최종 라이브러리는 Illumina Miseq v2 (PE150)를 사용하여 쌍으로 배열되었다(Ilumina, San Diego, CA, USA). 지우개 주파수는 Cas-Analyzer(www.rgenome.net)를 사용하여 정량화했다. 프로토스페이서-인접 모티프 서열로부터 업스트림 지역 3-bp의 인델은 Cas9에 의한 모티프 서열로 고려되었다.
효소연관면역흡착측정법
혈액 AT 농도는 ELISA가 mATIII ELISA 키트(영국 케임브리지주 Abcam)를 사용하여 측정했으며, ELISA는 제조업체의 지침에 따라 혈장을 사용하여 수행했다. 흡수도는 450 nm에서 분광광도계(Tecan, Zurich, Switzerland)로 측정하였으며 측정된 광학 밀도 값을 표준 곡선에 적용하여 AT 농도를 계산하였다.AST와 ALT는 AST/ALT 활성 분석 키트(미국 텍사스주 휴스턴의 Apexbio)를 통해 측정되었습니다. 혈장은 AST 및 ALT 분석을 위해 각각 제공된 검사 버퍼 1:9와 1:3으로 희석되었다.AST/ALT 검사는 제조업체의 지침에 따라 수행되었습니다. 흡수도는 분광광도계(스위스 취리히 테칸)로 측정되었으며 AST와 ALT 분석은 각각 450nm와 570nm였다. 염증성 사이토카인 생성을 분석하려면WT 마우스에는 LNP 또는 LNP-CRISPR-mATthrice 1.2mpk를 7일 간격으로 꼬리 정맥에 주입했다. 최종 주사 후 24시간 이내에 전정맥에서 혈액을 채취하였고, 혈청 TNF-ℓ 및 IL-1ℓ 농도는 ELISA(Bioss, Wawurn, MA, USA)를 사용하여 측정하였다.
보정된 자동 혈전 조영(CAT)
트롬빈 생성은 테크노트롬빈 TGAkit(Diapharma, West Chester, OH, USA)을 사용하여 측정되었다. 간략하게 혈장희석 40 µl, 시약 C 저완충액 10 µl, 기질 50 µl의 혼합물을 단일 웰에 넣어 1분 간격으로 360/450 nm(여기/방출)에서의 형광을 120분간 측정하였다.트롬빈 생성의 형광 측정은 Cytation 5(BioTek, Winuski, VT, USA)를 사용하여 96웰 판에서 수행되었다.트롬빈 생성 곡선은 제조업체가 제공한 소프트웨어를 사용하여 계산되었습니다.
조직학적 분석헤마톡실린과 에오신 얼룩에서 탈파라핀화된 조직은 메이어의 H&E 용액 0.1%에 의해 착색되었다. 자동 형광 검출을 위해 탈파라핀화된 조직을 4ℓ,6-다이아미디노-2-페닐린돌(DAPI)로 착색시켰고, 470-nm, 530-nm 파장의 시그널을 Cytation 5(BioTek)로 검출했다. 현미경으로 이미지를 획득한 후 이미지J 프로그램(NIH, Rockville Pike, MD, USA)으로 이미지를 분석했습니다. 모든 영상이 8비트 그레이스케일로 변환된 다음 "Adjust > Threshold" 명령에서 "Image"를 선택했습니다. 각 이미지의 모든 평균값은 ImageJ 소프트웨어에 의해 자동으로 측정되었습니다.
대상 외 분석
잠재적인 표적 이탈 부위는 in silico 도구, Off-finder(www.rgenome.net)를 사용하여 처음 식별되었다. 최대 3-bp 불일치를 포함하는 마우스 게놈 사이트는 표적 외 사이트로 간주되었고 표적 심층 시퀀싱에 의해 추가로 확인되었다. 디제놈섹(33)에 의해 표적에서 벗어난 추가 후보들이 얻어졌다. 간단히 말하면, 적절한 완충액 [100 mM NaCl, 50 mMtris-HCl, 10 mM MgCl2 및 bovine serum album (100 µg/digested)에 SpCas9(300 nM) 및 sgRNA(900 nM)를 사용하여 인간 게놈 DNA(8µg)를 시험관내 절개 후o Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). DNA 조각의 끝부분은 어댑터로 연결되었고, 최종 라이브러리는 일루미나 HiSeq X Ten Sequencer(미국, 샌디에이고, 캘리포니아)를 사용하여 WGS(전체 게놈 염기서열 분석)를 통해 배열되었다. 시퀀싱된 판독값을 마우스 게놈 참조 GRCm38에 매핑한 후 생성된 BAM 파일을 Digenome-Seq 도구(www.rgenome.net)를 사용하여 분석했다. 2.5 이상의 절단 점수를 보이는 위치는 잠재적 대상 외 부위로 선택되었고 표적 심층 시퀀싱에 의해 추가로 검증되었다. 표 S1과 S2에 각각 표적을 벗어난 후보자에 대한 표적 사이트와 프라이머 정보가 나열되어 있다.
T 세포 자극 및 세포 내 사이토카인 염색
생쥐에게 빈 LNP, sgRNA/Cas9 mRNA에 포함된 LNP, PBS를 세 번 주입했다. 마지막 주입 후 24시간 후, 생쥐의 스플렌으로부터 단세포 정지가 준비되었다.세포(1 × 106)는 배지 단독 배양(음성 대조군), 2.5µg의 재조합 Cas9(Cas9) 또는 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)와 아이오마이신(양성 대조군)으로 18시간 동안 배양되었다. IFN을 생성하는 세포를 측정하기 위해 스플레노사이트를 브레펠딘 A(eBioscience Inc., 샌디에이고, CA, 미국)로 5시간 동안 추가로 처리했다. 세포를 0.5% 사포닌(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 함유된 형광활성세포정렬(FACS) 완충제로 투과시키고 마커로 착색시켰다.착색된 셀은 CytoFLEX S 유동 세포계(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 획득하고 FlowJosoftware(TreeStar Inc., Ashland, OR, USA)를 사용하여 분석했습니다. 사용된 항체는 항원제시세포(APC)/Cy7 항마우스 CD3(바이오레전드, 샌디에이고, CA, USA, 100706)와 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 항마우스 CD8(바이오레전드, 100222) 및 피코마우스(PE)였다.
항 Cas9 항체 반응 측정
항 Cas9 항체 반응은 ELISA를 사용하여 측정되었습니다. 간단히 말해서 96웰 판은 37℃에서 3시간 동안 SpCas9 단백질(Aldevron, 9212) 1개 웰당 0.1µg을 코팅하였다. 이어서 판을 4회 세척한 후 25℃에서 1시간 동안 검사 희석버퍼(BioLegend, 421203) 100µl를 첨가하여 막았다. LNP-CRISPR-mAT 또는 AAV9-Cas9을 주입한 마우스에서 혈청을 40회 희석한 후, 혈판을 25℃에서 2시간 동안 시료와 함께 배양하였다. 세척 후, 판은 고추냉이 과산화효소(HRP; 시그마, A9044;시그마-알드리치)를 세척한 후 트리메틸보론(TMB) 기질로 처리했다(바이오레전드, 421101). 정지 용액(BioLegend, 423001)을 사용하여 HRP/TMB 반응을 정지시킨 후 450nm에서 흡수도를 측정하였다. 상용 마우스 항Cas9 항체(Abcam, 191468)가 표준 곡선 테스트에 사용되었으며, 표준 곡선(R2 = 0.989)이 테스트 검체의 항Cas9 IgG 농도를 결정하는 데 사용되었다.
통계분석
통계 분석은 GraphPad Prism(버전 5.02, GraphPad, San Diego, CA, USA)을 사용하여 짝을 이루지 않은 학생의 t 테스트 및 상관 분석을 수행했다.
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