SUPT4H1이 편집한 줄기세포 치료법은 헌팅턴병에 대한 마우스 모델에서 뉴런달드 기능을 구한다.
※ 해당 논문은 파파고를 통해 번역하였습니다.
원본 - 툴젠, 차의과학대, 아이피에스바이오 공동연구 논문
박현정✉, 한아름1, 김지연1, 최지우1, 배희숙2, 조규본2, 신혜정2, 신은지2, 이강인2, 김석중2, 이재영2✉, 송지환1✉3
헌팅턴병(HD)은 헌팅틴 유전자(HTT)의 CAG 반복 확장으로 인해 돌연변이 헌팅틴이 폴리글루타민 반복으로 축적되면서 발생하는 심각한 유전 신경질환이다. 그 심각성에도 불구하고, 이 쇠약해지는 질병에 대한 치료법은 없다. 항센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 포함한 HTT 하강 전략은 매우 최근에 유망한 결과를 보여주었다.줄기세포 기반 치료제를 개발하려는 시도는 임상 전 HD 모델에서 효과를 보여주었다. 유전적 결함이 있는 HD 환자안심세포를 사용하면 돌연변이 HTT로 인해 치료 효능을 저해할 수 있다. 돌연변이 HTT 발현과 전사를 줄이기 위해 이러한 세포를 전처리하면 이식된 세포의 치료 효능을 향상시킬 수 있다. 이를 조사하기 위해 긴 트리뉴클레오타이드 반복의 전사를 선택적으로 지원하는 SUPT4H1 유전자를 웨타겟팅했다. SUPT4H1 편집 HD 유도 만능 줄기세포 유도 신경 전구 세포(iPSC-NPC)를 YAC128 HD 유전자 전이 마우스 모델에 이식하면 편집되지 않은 HD iPSC-NPC에 비해 운동 기능이 향상되었다. 면역 화학 분석 결과 야생형 HTT 발현을 보상하지 않고 돌연변이 HTT 발현이 감소된 것으로 나타났다. 또한 SUPT4H1 편집은 편집되지 않은 HD iPSC-NPC에 비해 HD iPSC-NPC에서 뉴런을 증가시키고 반응성 세포 분화를 감소시켰다. 이는 SUPT4H1의 생체 외 편집이 돌연변이 HTT 발현을 감소시키고 HD에서의 자가 줄기세포 이식을 위한 치료적 유전자 편집 전략을 제공할 수 있음을 시사한다.
npj 재생의학 (영문) 7:8; https://doi.org/10.1038/s41536-021-00198-0
소개
헌팅턴병(HD)은 헌팅틴 유전자(HTT) exon 11에서 CAG 반복(>40)이 비정상적으로 확장되어 발생하는 진행성 신경퇴행성 신경감소증이다. 확장된 CAG트리뉴클레오타이드는 신경독성 단백질인 세포질 및 핵내 집단에 축적될 수 있는 폴리글루타민 스트레치를 암호화한다. HD 환자는 측면 심실 크기에서 진행성 뇌위축증을 보인다. 이러한 변화는 인지결손, 운동조절장애, 그리고 심리증상으로 이어진다.현재 HD에 대한 질병 수정 치료법이 없으며, 결과적으로 상당한 의료 수요를 충족시키지 못한다. 인간줄기세포를 기반으로 한 효과적인 회복 또는 신경퇴행성 전략은 잠재적인 치료법이다. 인간 배아유래신경줄기세포3 또는 쥐 유도만능줄기세포(iPSC)유래신경줄기세포4를 HD유전성(TG)생쥐에 이식하면 신경세포나 성상세포 분화가 촉진돼 기능적 이점이 있는 것으로 나타났다. 환자 특이적 iPSC는 줄기세포 치료를 위한 자가 세포의 자발적 재생 가능한 원천으로, 면역 거부 반응을 유도하지 않는다. 그러나 유전질환 환자로부터 파생된 iPSC는 돌연변이를 가지고 있다.따라서 이식 전 유전자 변형은 자가 iPSC 치료의 치료 가능성을 높일 수 있다.HTT는 CRISPR/Cas9, siRNA 또는 orantisense 올리고뉴클레오타이드(ASO)를 사용한 유전자 녹아웃 또는 녹다운이 신경독성을 8–12로 구조하기 때문에 HD에서 표적이 될 수 있는 명백한 후보 유전자이다. ASO를 포함한 HTTlowing 전략은 유망한 접근법으로 간주되었다. 그러나 이러한 방법들은 HTT(mHT)와 정상 HTT를 녹다운시켜 정상 HTT의 생리학적 역할을 증가시킨다. HD 유전자 인미스의 삭제가 초기 배아 치사율을 초래하기 때문에 정상적인 HTT는 발생에 필요한 것으로 생각된다. 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 통한 mHTT의 대립 유전체 특이적 타겟팅이 제안되었다. 그러나 모든 HD 환자가 mHTT의 대립 유전자에 특화된 녹다운을 허용하기 위해 SNP를 보유하는 것은 아니다. 따라서 야생형 HTT 수준을 감소시키지 않고 mHT 수준을 줄이기 위한 보편적인 유전자 조작을 식별하는 것은 모든 HD 환자에게 유용할 것이다.SPT4는 SUPT4H1에 의해 암호화되고 RNA 중합효소 II 공정성을 17-19로 조절하는 전사 신장 인자이다. 한 사례 보고서는 SPT4가 HD20에서 트리뉴클레오타이드 및 헥사뉴클레오타이드 반복 확장의 특정 발현에 필요하다고 나타냈다.반복 확장 돌연변이로 인한 돌연변이 생성물을 구체적으로 줄이기 위해 SPT4를 치료 목적으로 하는 것이 조사되었다. HD의 경우 SUPT4H1 녹다운은 야생형 HTT 수준의 보상적 증가 없이 Q81 또는 Q111 신경 세포에서 mHTT 발현이 감소하였다. 또한 반복적인 트리뉴클레오타이드20을 억제하여 mHTT 응집 및 독성을 감소시켰다. 또한 Q175 마우스 HD 모델에서 SUPT4H1 표적화 항고세 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 SUPT4H1, SUPT4a의 마우스 상동성을 억제함으로써 mHT mRNA와 단백질 발현21을 감소시켰다. R6/2HD 마우스에서 SUpt4a 유전자의 이형성 삭제는 mHTT mRNA와 단백질 발현을 감소시켰다.이러한 이유로, 인간 HD 환자에서 파생된 iPSC-NPC에서 SUPT4H1(SUPT4H1 편집)의 표적 절제가 마우스 HD 모델을 사용한 자가 줄기세포 치료 iPSC-NPC의 치료 가능성을 증가시키는지 조사했다. 이식된SUPT4H1로 편집된 HD iPSC-NPC는 이식 후 12w에서 수정되지 않은 HD iPSC-NPC보다 생성이 더 우수했다. 게다가, 분화된 뉴런과 성상세포는 비슷하게 개선되었다. 회선 ID: ND41656, RUCDR 셀 회선 서비스) 우리는 이러한 iPSC를 NPC로 구별하기 위해 체외임브료이드 바디 기반 SFEBq 방법을 사용했다.CRISPR/Cas9(SupplementalFig. 1a)을 사용하여 NPC를 대상으로 하는 sgRNA에 대한 SUPT4H1 exon1의 최적 영역을 선별하고 식별했다. 대조군으로 예약된 AAVS1의 sgRNA 표적 비코딩 영역. 표적 심층 시퀀싱 분석은 AAVS1과 SUPT4H1 위치에서의 효율적인 유전자 편집이 93.6 및 95.7%의 총 제거 효율성(비HD의 경우 평균 29.5%, 프레임 외 돌연변이의 경우 평균 64.1%, HD 돌연변이의 경우 27.9%, 프레임 외 67.9%)에 도달했음을 보여주었다.ig.1a 및 추가 표 1) 유전자 편집에 따른 SUPT4H1 mRNAkdown을 확인하기 위해 qRT-PCR 분석을 실시하여 비HD 및 Q57 HD iPSC-NPCS 모두에서 SUPT4H1 유전자 편집(부록 그림 1b)에 대한 강력한 녹다운이 나타났다. NPC 특성화를 위해 NPC 양성 마커(anti-SOX2, NESTIN, MUSASHI)와 NPC 음성 마커(anti-MAP2)를 사용하여 Imunostaining을 수행했다. NPC 마커를 사용한 면역 억제(SuppetaryFig. 1c)로 판단한 SUPT4H1 유전자 편집 후 NPC 특성의 변화는 관찰되지 않았다. IXMC 분석은 처리된 모든 그룹이 NPC 마커에 대해 90% 이상의 양성 착색을 보였다(보충 그림 1d). 특히 SUPT4H1 유전자 편집은 세포 생존력에 변화를 일으키지 않았다(보조 그림 1e). 또한 SUPT4H1 유전자 편집 후 녹형 변화가 검출되었다(보충그림 2). 유전자 편집에 따른 SPT4 단백질 녹다운 확인을 위해 AntiSPT4 및 NPC 마커인 Anti-NESTIN을 사용하여 면역관리를 수행했다. Q57 HDiPSC-NPCs의 SPT4 발현은 대조군 NPCs(AAVS1- 또는 SUPT4H 편집)에 비해 증가하였다. 반대로 SUPT4H1-editQ57 HD iPSC-NPCs는 감소된 SPT4 발현을 보였다. 웨스턴 블랏 분석(Western Blot Analysis)에서도 동일한 결과가 나타났다(보충 그림 1f).HDiPSC-NPC에서 매우 효율적인 SUPT4H1 유전자 편집을 달성한 후 42d에 걸쳐 신경 세포로 자연 분화를 진행했다(그림 1a). 분화하기 전에, Weshowed NPC 특성화는 네스틴과 SOX2의 면역 형광을 사용하여 이루어졌다(그림 1b). 분화 후, 우리는 immunofluorescence와 western bloting을 수행했고 SUPT4H1 유전자 편집이 마커 형태인 EM48 발현을 감소시켰다는 것을 발견했다.HTT 단백질, HD 세포에서 AAVS1 유전자 편집 비교(그림 1c, d). Western Blot 데이터와 상관 관계를 유지하기 위해 RTqPCR을 수행했고 SUPT4H1 유전 Q57 HD NPCs에서 HTT의 표현이 감소했음을 발견했다(보충 그림 3).흥미롭게도, AAVS1 편집 Q57 HD iPSC 파생 MAP2 또는 GFAP 양성 세포가 대조군 또는 SUPT4H1 편집 그룹과 비교하여 다른 형태를 보인다는 것을 관찰했다(그림 1, h).MAP2 양성 세포 성숙은 웨스턴블로팅(Westernblotting)으로 처음 확인되었다(그림 1f). 낮은 분자량(LMW) MAP2 동질효소는 엑손 E7-E9에 의해 인코딩된 서열이 제외되어 발생하는 미성숙 형태이다. 고분자량을 포함한 E7-E9 엑손(HMW) 동질효소가 선호될 때 뉴런 발달 초기 단계에서 하향 조절된다. AAVS1 편집 그룹에서 HMWMAP2 식이 관찰되었지만 SUPT4H1 편집 그룹은 AAVS1 편집 그룹에 비해 HMW-MAP2 식이 크게 증가했습니다.다음으로 보다 신뢰할 수 있는 증거를 위해 MetaXpress를 사용하여 MAP2 양성 세포 형태를 분석했다. SUPT4H1 편집Q57 HD iPSC 파생 MAP2 양성 셀은 AAVS1 편집 Q57 HD iPSC 파생 MAP2 양성 셀에 비해 훨씬 더 많은 총 외형 성장과 최대 외형 길이를 보였다(그림 1g). 또한 웨스턴 블랏은 GFAP와 칼륨 채널 Ki4.1의 발현을 밝혀냈다. SUPT4H1 편집 그룹은 AAVS1 편집 그룹에 비해 GFAP 및 Kir4.1 발현량이 증가했다(그림 1i). 분화된 뉴런과 아스트로사이트를 식별하기 위해, 우리는 그것들을 검사했다.성숙한 뉴런의 경우 GABA 및 DARPP-32의 RNA 발현, 방사형 신경아교세포와 성숙한 성모세포의 경우 각각 N-캐드헤린(CDH2) 및 S100β 발현. SUPT4H1 편집 그룹은 AAVS1 편집 그룹과 비교하여 GABA 및 DARPP-32 mRNA 발현에서 유의미한 증가를 보였다(보충 그림 4). 또한 SUPT4H1 편집 그룹은 AAVS1 편집 그룹과 비교하여 CDH2 및 S100β mRNA에서 유의미한 증가를 보였다(그림 1j). 따라서 mHTT 발현이 감소된 SUPT4H1 편집 Q57 HD iPSC-NPC는 대조군 iPSC 유도 NPC와 유사한 정상적인 신경 분화를 겪었다.유전자 편집을 사용하여 HTT를 쓰러뜨리면 mHTT가 감소하지만, 정상적인 야생형 HTT 수준도 감소하여 신경 발달에 중요한 역할을 한다. 이를 조사하기 위해 HTTgene의 시작 코돈을 대상으로 sgRNA를 사용하여 HTTgene 편집을 수행했다(보충 그림 5a). 우리는 AAVS1과 SUPT4H1 표적 sgRNA 사이에 유사한 유전자 편집 효율성을 달성했다. HTT 편집된 Q57 HD iPSC-NPC는 SUPT4H1 편집 그룹에 비해 불완전한 분화를 보였다. MAP2-양성 세포 형태학과 관련하여, 대조군 또는 AAVS1 또는 SUPT4H1 편집 그룹에 비해 HTT 편집 그룹에서 총 뉴라이트 수와 최대 뉴라이트 렝스 값이 크게 감소했다(보충 그림 5b, c). 흥미롭게도, HTT 편집 그룹의 MAP2 양성 세포는 AAVS1 편집 그룹에 비해 더 높은 성숙도를 나타내지 않았다. HTT 편집 Q57 HDiPSC-NPC가 결함 있는 신경 발달을 보였기 때문에 SUPT4H1 편집 Q57 HD iPSC-NPC에 초점을 맞추기로 결정했다.
YAC128 HD 마우스에서의 SUPT4H1 편집 Q57 HD iPSC-NPC 이식의 기능 향상 및 신경 보호 효과
SUPT4H1 편집 및 비편집 Q57 HD iPSC-NPC의 치료 가능성을 비교하기 위해, 우리는 이 세포들을YAC128 쥐들이 128번의 CAG 반복으로 mHTT를 품고 있다. 우리는 SUPT4H1이 편집한 HD iPSC-NPCs가 이식 후 3m에서 YAC128 생쥐의 로타로드 테스트에서 모토디핏을 구조했는지 조사했다(그림 2a). 편집되지 않은 Q57 HD iPSC-NPC를 주입한 생쥐는 주입 후 최대 1m까지 운동 결손 지연을 보인 반면, SUPT4H1 편집된 Q57 HD iPSC-NPC를 주입한 생쥐는 주입 후 최대 3m까지 운동 기능을 유지하였다(그림.2; p < 0.01). YAC128 생쥐는 일반적으로 미세하게 결핍을 보인다.
모터 제어 및 그립 강도. 따라서 SUPT4H1 편집 Q57 HD iPSC-NPCs를 이식한 YAC128 생쥐가 비편집 Q57 iPSC-NPCs 이식 그룹에 비해 이식 후 3m에서 현저하게 향상된 성능을 보였다(그림 2b, p < 0.01). 이 결과는 비슷했다.
제어 iPSC-NPC를 이식한 환자(보충 그림 6). 다음으로 이식된 SUPT4H1 편집 Q57 HD iPSC-NPC(Q57/SUPT4H1)가 YAC128 생쥐의 뇌에서 신경 생존에 보호 효과를 제공하는지 조사했다. 그룹당 5마리의 생쥐의 선조체 섹션 3개가 뉴런 핵(NeuN) 항체로 얼룩졌고, 뉴런 양성 뉴런의 강도는 매체 또는 Q57 HD iPSC-NPC 이식 후 3m 후 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량화됐다. YAC128 생쥐는 WT에 비해 유의미하게 줄어든 NeuN 양성 밀도를 보였다. 그러나 SUPT4H1 편집Q57 HD iPSC-NPCs를 이식한 YAC128 생쥐는 신경 양수 밀도가 크게 증가했다(그림 2c, d).
SUPT4H1로 편집된 Q57 HD iPSC-NPC는 YAC128 생쥐에서 편집되지 않은 세포보다 잘 생성되었다.
SUPT4H1 편집 Q57 HD iPSC-NPC가 편집되지 않은 세포에 비해 치료 능력을 보였기 때문에, 다음으로 이식 후 이러한 세포의 운명을 조사하였다. 인간 고유의 네스틴(hNESTIN)에 대한 면역 형광 분석 결과 이식된 SUPT4H1 편집 Q57에서 SPT4 발현이 없음을 확인했다.HD iPSC-NPC, 이식된 인간 세포를 나타냅니다. 그러나 주목할 만한 SPT4 발현은 이식 후 1주일 동안 비편집 세포에서 발견되었다(그림 3a). 우리는 Zen black software의 콜로컬화 분석을 사용하여 면역 형광 이미지에서 병합된 hNESTIN과 SPT4의 픽셀 수를 계산했다(그림 3b).SUPT4H1 편집 및 비편집 세포 이식 그룹 3 매프터 이식 그룹의 선조체에서 인간 핵(hNu) 양성 세포가 관찰되었으며(그림 3c), 이는 이식된 iPSC-NPC가 YAC128 생쥐의 선조체에서 생존했음을 나타낸다. 그러나, 비편집 세포 이식 그룹의 선조체에서 총 hNu 양성 세포의 수는 SUPT4H1 편집 세포 이식 그룹(54,280 ± 823 또는 선조체에서 약 13.5 또는 전체 이식 세포 수의 32.2%)보다 상당히 적었다. HMAP2 양성 세포(그림 4c)와 비교하여 수정하지 않은 Q57 HD iPSC-NPCs(그림 5a)를 이식한 YAC128 생쥐에서 hNupositive 세포와 함께 국소화된 GFAP 양성 세포가 더 많이 관찰되었다. 대조적으로, SUPT4H1 편집 Q57 HD IPSC-NPCs로 이식된 YAC128 생쥐에서 더 많은 hMAP2 양성 뉴런이 검출되었다(보충 그림 7).
SUPT4H1 편집 Q57 HD iPSCNPC와 구별되는 뉴런은 YAC128 생쥐에서 개선된 형태를 보였다.
더 많은 세포가 생존함에 따라, 우리는 이식된 SUPT4H1 편집 Q57 HD iPSC-NPC가 중간 가시 뉴런(MSN)으로 분화할 수 있는지 또는 다른 형태학을 보일 수 있는지 여부를 추가로 조사했다. 이를 위해 hNuand DARPP-32 항체로 얼룩진 조각을 이중으로 만들었다(그림 4a). 편집되지 않은 Q57 HDiPSC-NPC로 이식된 YAC128 생쥐의 병합된 hNu/DARPP-32 양성 세포는 SUPT4H1-편집 그룹에 비해 DARPP-32 양성 뉴런의 결함 형태학과 같은 건강하지 않은 형태를 보였다(그림 4a). 비편집 그룹의 세포는 SUPT4H1 편집 그룹에 존재하지 않는 EM48 집계를 가졌다(그림 4b). 체외 연구에서처럼 뉴런 성숙 형태를 식별하기 위해, 우리는 ahuman-specific MAP2(hMAP2) 항체를 사용하여 Immunofluescence 및 MetaXpress 소프트웨어 분석을 수행했다. 흥미롭게도, 우리는 무편집 Q57 HD iPSC-NPC가 이식된 YAC128 생쥐의 hMAP2 양성 세포가 SUPT4H1 편집 그룹에 비해 덴드라이트가 짧고 직선형이 없다는 것을 발견했다(그림 4c). MetaXpress 소프트웨어 분석은 SUPT4H1 편집 그룹에서 hMAP2 양성 세포의 성장 번호와 최대 길이가 편집되지 않은 그룹에 비해 크게 증가했음을 밝혔다(그림 4d).
SUPT4H1로 편집된 Q57 HD iPSCNPC와 구별되는 성상세포는 YAC128 생쥐에서 반응성 성상세포를 감소시켰다.
다음으로 우리는 이식된 SUPT4H1 편집-Q57 HDiPSC-NPC가 아스트로사이트(GFAP)로 분화할 가능성이 있는지 조사했다. 슬라이스는 hNu 및 GFAP 항체로 이중 얼룩졌다(그림 5a). 편집되지 않은 Q57 HD iPSC-NPCs로 YAC128 미세변환된 HNu/GFAP 양성 세포는 SUPT4H1 편집 그룹과 비교하여 반응성 성상세포의 비대칭 형태를 보였다(그림 5a). 또한, 비편집 그룹의 세포는 SUPT4H1 편집 그룹에 존재하지 않는 HTT 집단을 가지고 있었다(그림 5b). 반응성 우주 세포를 식별하기 위해 얼룩진 조각을 인간 GFAP(hGFAP)에 대한 항체와 결합하고 성분 3(C3)을 보완하며 반응성 우주 세포 마커로 간주하고 면역 형광을 사용하여 분석한다.SUPT4H1 편집 그룹에 비해 편집되지 않은 Q57 HD iPSC-NPCscompomplex로 이식된 YAC128 생쥐에서 hGFAP/C3 양성 세포 발현 증가가 관찰되었다(그림 5c). 메타엑스프레스소프트웨어 분석 결과 AAVS1 편집 그룹에서 GFAP 양성 세포의 면적과 강도가 크게 증가해 반응성 성상세포 형태를 보였지만 SUPT4H1 편집 그룹은 반응성 성상세포 형태를 보이지 않았다(그림 5d). 따라서, 우리는 mHTT 단백질이 고도로 축적된 YAC128 마우스 뇌 환경이 정상적인 성상세포를 반응성 성상세포로 변환한다고 제안한다.
논의
이 연구는 SUPT4H1이 Q57 HD iPSC-NPC이식술이 YAC128 생쥐의 손상된 뇌에서 운동기능을 안정화하고 신경보호 기능을 향상시켰다는 것을 입증했다. 우리는 HD iPSC-NPC에서 SUPT4H1 유전자 편집이 자가 줄기세포 치료와 관련된 면역 억제 위험을 피하면서 정상적인 신경 분화와 기능 회복을 촉진할 수 있음을 보여준다. HD와 같은 유전 질환의 경우, 자가 줄기세포 치료법을 개발하는 데 있어 유전자와 세포 요법을 결합하는 생체 외 접근법이 매우 유용할 것이다.실험 및 임상 전 연구는 1990년대 HD 환자에 대한 최초의 신경 이식 임상 시험의 시작을 지지했다. 인간 태아 조직에서 돼지 선조체 세포에 이르기까지, 여러 세포원이 HD 환자 24-28의 임상시험에 사용되어 왔다.그러나 결과는 매우 다양했고 운동 26과 신경 심리학적 결과에 대한 임상적 이점은 미미했다. 이식 생존과 뉴런 분화는 자기공명영상을 사용하는 환자들을 대상으로 연구되었다. 대조적으로, iPSC는 재생의학에서 사용될 수 있는 무한한 환자용 세포 공급원을 생산할 수 있다.그러나 자가 세포의 돌연변이 유전자는 비정상적인 신경 분화를 일으킬 수 있고 정상적인 생리적 기능을 방해하여 HD의 줄기세포 치료를 위한 세포 편집이 필요하다. 본 연구에서는 SPT4를 완화하면 YAC128 마우스에서 mHTT와 관련된 신경학적 결함 개선에 기여할 수 있음을 보여주었다.
먼저 HTT와 SUPT4H1의 Q57 HD iPSC-NPC를 비교했다.HTT는 글로벌 유전자 발현과 세포막 기능 장애를 일으킨다. 따라서 mHTT 유전자 녹아웃 또는 녹다운은 HD 유전자 치료의 초점이 될 수 있다. 그러나 내인성 HTT 유전자의 정상 및 확장형 유전자는 siRNA 또는 항센스 올리고뉴클레오타이드 11,12로 쉽게 구별되지 않는다. HTT 손실 및 돌연변이 쥐 배아 줄기세포는 전구자 규격을 손상시키고 31,32의 성숙과 표적 유전자 변형 결과 신경 세포 수가 적고 뉴라이트 길이가 줄어든다33. 현재의 연구는 노멀 및 확장 대립 유전자에 존재하는 HTT 유전자를 유사하게 편집했다. 우리의 결과는 HTT 편집 Q57 HDiPSC-NPCs가 뉴런 분화와 뉴라이트 길이를 줄였다는 것을 보여주었는데, 이는 HTT 유전자 절제가 신경 분화와 체외 뉴런 생존을 감소시켰다는 것을 나타낸다. 이것은 아마도 우리의 CRISPR/Cas9 HTT 전략이 야생형과 돌연변이 대립형질을 구별하지 못했기 때문일 것이다. 또한, 완료HTT 녹아웃은 신경 발달에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.SNP 연관성을 기반으로 한 CRISPR/Cas9과 함께 mHTT를 대상으로 하는 대립 관계별 타겟팅이 최근에 개발되었다. 그러나 이 접근법은 환자의 SNP와 mHTT 사이의 다양한 연관 패턴에 의해 제한될 수 있다. 또한 CRISPR/Cas9의 표적 부위에서 염기쌍이 하나라도 다르면 질적이 아닌 염기쌍이 분열될 가능성이 높아져 야생형 HTT 유전자의 잔여 분열 가능성이 높아진다.따라서, 우리는 전사 신장 인자인 SPT4가 HD iPSC-NPCs 편집에 이상적인 후보 유전자가 될 것이라고 판단했다.결함이 있는 SPT4를 가진 효모와 동물 세포는 mHTT17,20과 같은 긴 폴리Q 스트레칭을 포함하는 단백질 합성이 감소된 것을 보여준다. 요실크러스트, SPT4 유전자 결함은 세포 mRNA 합성을 바꾸지 않는다.또한, SPT4 항센스 2'-오메톡시에틸 올리고뉴클레오타이드와 SPT4 원카피 삭제 R6/2를 주입한 HD Q175 마우스는 mHTT mRNA와 단백질 발현에서 선택적 감소를 보였다.
또한 SPT4 원카피 삭제 R6/2 생쥐는 장기 수명 및 지연 운동 장애를 보였다.이러한 이유로, 우리는 SPT4 녹아웃 오크다운이 선택적으로 감축을 위한 최고의 접근법일 것이라고 가정했다.HTT. 본 연구는 SUPT4H14 편집 Q57 HD IPSC-NPCs의 생체 내 및 체외 기능을 조사했다. 우리의 첫 번째 결과는 SUPT4H1 편집 Q57 HD iPSC-NPCs가 감소된 SPT4 단백질 수준을 보인다는 것을 입증했다. 이중 HTT 편집 Q57과 비교HD iPSC-NPC, SUPT4H1 편집된 세포는 뉴라이트 길이가 증가하고 mHTT 단백질의 표현이 감소하면서 뉴런 세포로 분화할 가능성이 더 높았다.
둘째, 우리의 결과는 편집되지 않은 Q57 HD iPSCNPCs가 뉴런보다 아스트로사이트로 분화할 가능성이 더 높다는 것을 보여주었다. HD Q140 Knock-in NSC 또는 인간 HD iPSC(60, 109, 180Q)-NPCs는 뉴런의 적응을 조절하는 BDNF 발현 결함으로 인해 NPC의 수를 줄이고 성숙한 뉴런의 수를 줄였으며, 더 많은 성체 세포를 생성했다고 보고되었다. 우리의 이식 결과는 수정되지 않은 Q57 HD iPSCNPC가 아스트로사이트로 분화할 가능성이 더 높은 반면,SUPT4H1 편집 Q57 HD IPSC-NPC는 성숙한 뉴런으로 분화할 가능성이 높았다. 따라서 추가 연구가 필요하지만, 이러한 결과는 SUPT4H1 유전자 편집을 통해 mHTT를 감소시키면 생체 내 이식에 따른 신경 분화를 향상시킬 수 있음을 시사한다.셋째, SUPT4H1이 편집한 Q57 HD iPSC-NPCsimp가 신경 치환만큼 중요한 성상세포 기능을 검증했다는 것을 발견했다. HD 환자의 뇌에는 반응성 성상세포, 더 큰 소마, 그리고 글루탐산염 수송체 감소와 관련된 비정상적인 기능이 포함되어 있다.
또한 비정상 성상세포는 HD 병리생리학 35~37에 관여한다.우리의 결과는 SUPT4H1이 편집한 Q57 HD iPSCNPC가 mHTT 발현이 감소했기 때문에 덜 반응적인 성상세포를 형성했다는 것을 보여주었다. 따라서 SUPT4H1 편집 Q57 HD iPSC 유도 아스트로사이트는 HD 뇌 환경을 개선할 수 있다.또한 흥미로운 iPSC 특성화 결과를 시연했다. 여러 연구에서 HD 환자의 iPSC 또는 파생된 NPC가 mHTT 발현 없이도 정상적으로 작동한다는 것이 입증되었다. 예를 들어, mHTT를 가진 인간배아줄기세포는 분화 이후 약 2m의 관련 병리를 나타낸다. HD를 가진 청소년과 성인의 환자 유래 iPSC는 배양 42 또는 이식 43 6m 후 신경 내 mHTT 발현을 보였다. 유비퀴틴 단백질 시스템은 신경 분화 과정에서 정상적인 기능을 상실한다. 본 연구에서는 편집되지 않은 Q57 HD iPSC-NPC로 이식된 YAC128 생쥐가 1 mpost-이식 시 운동회복을 보였다. 그러나 이 쥐들은 mHTT를 가지고 있었는데, 이는 신경 분화 감소와 관련이 있었다.
따라서 우리의 결과는 YAC128 생쥐의 편집되지 않은 Q57 HD iPSC 파생 뉴런 또는 아스트로사이트의 mHTT가 iPSC-NPC의 추출 및 분화를 방해할 수 있음을 보여준다.줄기세포 치료는 여러 질병에 대한 중요한 치료 전략이다. 더 효과적인 결과를 얻기 위해 수많은 임상 및 비임상 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 일부 연구 단체들은 줄기세포가 면역 거부 반응을 겪지 않을 수 있도록 유전자 편집을 시도하고 있다. 자가 줄기세포를 충분히 공급하면 면역 거부 반응을 겪지 않으면 최상의 치료법을 만들어낼 수 있다. 그러나 HD와 같은 유전자 돌연변이가 있는 환자는 유전자 교정이나 편집 후에만 iPSC를 이식해야 한다. 보다 쉽고 편리한 "보편적인" 유전자 편집 접근법은 유전자 교정과 같은 더 힘든 절차를 필요로 하는 문제의 특정 유전자 대신 규제 유전자를 목표로 하는 것이다. HD의 경우 자가 줄기세포 치료법을 개발하기 위한 적절하고 효율적인 전략으로 SUPT4H1 유전자 편집을 제안한다. 또한 SUPT4H1 유전자 편집 및 세포 치료의 조합에 기초한 생체 외 접근법은 C9FTD/ALS44와 같은 다른 반복 확장 돌연변이 관련 질병에서 자가 줄기세포 치료에 대한 추가 연구를 보장할 수 있다.
댓글